關于基因的科技論文范文3000字(2)
關于基因的科技論文范文3000字篇二
NOX1基因熒光素酶報告基因系統(tǒng)的建立
作者：劉珍 劉偉 劉行海 王伯瑤 黃寧 吳琦
【摘要】 目的：對炎癥細胞因子TNF?α及IFN?γ刺激下，人NOX1基因的表達調控進行初步分析。方法：將NOX1基因5′?端上游序列連接到無啟動子的PGL3?BASIC質粒，構建了PGL3?BASIC/NOX1報告質粒。PGL3?BASIC/NOX1質粒轉染A549細胞，用TNF?α、IFN?γ刺激12h，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測基因表達情況。結果：克隆的NOX1片段具有較強的啟動子活性，在TNF?α和IFN?γ共同刺激下，轉染報告基因的A549細胞螢光素酶活性與對照相比有明顯的增高(約4.3倍)。分析顯示NOX1基因5′?端上游序列片段含有NF?κB結合位點，提示細胞因子刺激的熒光素酶表達增強可能與NF?κB位點激活相關。結論：NOX1基因表達水平明顯受到炎癥細胞因子的調控，提示該基因可能參與機體免疫防御(特別是上皮細胞免疫防御)，值得進行深入研究。
【關鍵詞】 NOX1;報告基因;TNF?α;IFN?γ
還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NADPH oxidase, NOX)是一種多蛋白質亞基組成的復合物，表達于吞噬細胞和非吞噬細胞中，能產(chǎn)生對抗病原微生物的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，并參與細胞內信號傳導、炎癥反應及細胞增殖等過程[1]。在吞噬細胞(中性粒細胞、單核細胞)表達的NADPH氧化酶主要是gp91?phox(NOX2)。
NOX1是近年發(fā)現(xiàn)的gp91?phox同源分子，可在非吞噬細胞(上皮細胞、內皮細胞等)表達，當該基因表達增加時，細胞ROS產(chǎn)生增多，與細胞增殖和其他細胞行為相關[2-3]。目前報道最多的是關于NOX與機體絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)和酪氨酸蛋白激酶信號轉導的關系，ROS引起的細胞氧化還原狀態(tài)的改變，可激活由MAPK家族不同成員參與的信號轉導通路。一般認為NOX家族與機體免疫防御密切相關，但這些分子扮演的具體角色仍待確定，本實驗通過構建NOX1基因5′?端上游啟動子序列報告基因，初步分析NOX1基因的表達調控機制。
1 材料與方法
1.1 材料
人肺Ⅱ型上皮細胞株A549為本實驗室保存。熒光素酶報告基因載體pGL3?basic，海腎熒光素酶內對照報告載體pRL?TK及Dual?Luciferase Report Assay SystemPromega產(chǎn)品。PCR引物由寶生物工程公司合成，限制性內切酶購自MBI公司。DNA Ligation Kit 、PFU酶為TaKaRa 公司產(chǎn)品。質粒DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒及PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Omega 公司。轉染試劑lipofectamine2000購自invitrogen公司。TNF?α、IFN?γ購自PeproTech公司，其余為國產(chǎn)分析純。
1.2 方法
1.2.1 引物設計與PCR的擴增 根據(jù)GenBank中Nox1基因DNA序列(登錄號：DQ314883)，設計擴增Nox1啟動子序列，擴增片段長度為2096bp，在兩條引物分別加上KpnⅠ和XhoⅠ酶切位點。
上游引物P1：CGGGTACCTGAAGGTTGCAGTGAAGGGAGATC。
下游引物P2：GCCTCGAGGGTTTGGAGCCCTTCTAGGC。
PCR反應程序如下：94℃預變性3min;94℃變性40sec，58℃退火45sec，72℃延伸2min，30個循環(huán);最后72℃延伸10min。反應結束后取5μl PCR產(chǎn)物用0.7%瓊脂糖凝膠電泳觀察。
1.2.2 報告基因重組質粒的構建 用限制性內切酶KpnⅠ和XhoⅠ分別酶切PCR產(chǎn)物和質粒pGL3?basic，用DNA連接酶連接兩者，將構建好的重組質粒轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂板培養(yǎng)，提取質粒，DNA測序(大連寶生物公司)。
1.2.3 轉染 A549細胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉染前一天按照每孔8×104個細胞接種到48孔板，待細胞生長至融合度大于90%，換無血清培養(yǎng)基，用轉染試劑進行轉染，每孔分別轉染2.5μɡ的重組質粒，6小時后換為含小牛血清的DMEM培養(yǎng)基500μL，繼續(xù)于37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)，用于下一步細胞因子刺激實驗。轉染質粒為重組的熒光素酶報告基因載體pGL3?NOX1及海腎熒光素酶內對照報告載體pRL?TK，兩者的比例為200：1。
1.2.4 細胞因子刺激A549細胞 細胞轉染后的24-48小時內進行刺激實驗。用TNF?α，IFN?γ刺激A549細胞。實驗分組為TNF?α組，IFN?γ組，TNF?α+IFN?γ組。 TNF?α實驗用量為25ng·mL-1，IFN?γ實驗用量為10ng·mL-1。細胞因子用DMEM培養(yǎng)基稀釋，加入轉染后的A549細胞，刺激12小時，用Dual?Luciferase Report Assay System試劑盒中的裂解液PLB裂解細胞，收集裂解產(chǎn)物，10000轉/分離心10分鐘，上請儲存于-20℃。熒光素酶報告基因活性測定采用Beckman Coulter DTX880。實驗重復3次。用未刺激的轉染后的A549細胞做陰性對照。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行分析。
2 結果
2.1 報告基因重組質粒(pGL3?NOX1)的構建和鑒定
PCR產(chǎn)物電泳顯示擴增出的片段與實驗目的片段大小一致，將PCR片段插入質粒pGL3?basic，用限制性內切酶KpnⅠ及XhoⅠ雙酶切重組質粒，也切下相應大小的片段，最后采用DNA測序證實pGL3?NOX1質粒構建成功(圖1)。
2.2 細胞因子對pGL3?NOX1報告基因表達活性的影響
細胞因子TNF?α，IFN?γ刺激轉染了報告基因的A549細胞，于刺激后12小時裂解細胞，檢測熒光素酶活性。結果顯示單獨采用IFN?γ、TNF?α，或者聯(lián)合采用兩種細胞因子刺激，與轉染pGL3?NOX1報告基因而未加細胞因子的對照組(DMEM對照)比較，熒光素酶活性分別增加3.2、2.7及4.3倍。經(jīng)SPSS軟件分析，各實驗組與對照組相比，均為P<0.05。結果見表1和圖2。表1 TNF?α，IFN?γ對NOX1基因報告質粒在A549細胞在中表達的影響
3 討論
在中性粒細胞、單核細胞等吞噬細胞質膜上, 存在NADPH氧化酶,其主要亞基是gp91?phox,該酶被激活時能招募其他位于細胞質中的亞基,在膜上裝配成活化的全酶,是吞噬細胞呼吸爆發(fā)及依賴氧殺菌作用的關鍵分子。近年來在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了一組gp91?phox結構與活性同源的分子，于是NADPH氧化酶成為一個分子家族，共有7個成員，分別稱為NOX1?5，Duox1?2。最先在吞噬細胞發(fā)現(xiàn)的gp91?phox現(xiàn)在稱為NOX2。
目前對NOX2在機體抗感染免疫防御中的地位有相當深入的了解，但NOX家族其他成員的生理功能還有待研究。由于NOX2只是特異表達于吞噬細胞，NOX家族其他分子則廣泛表達于機體各組織器官，它們的生物學功能立即成為令人感興趣的問題。過去10年對活性氧的生物學活性有了更多認識,它們參與細胞生存、增殖、分化、衰老和死亡等重要生命過程,是一類信號分子[ 3-5]。NOX家族的發(fā)現(xiàn)，勢必促進組織細胞活性氧的生成代謝及調控機理研究。
鑒于NOX2在免疫防御中的重要功能，必然將NOX家族其他分子與機體抗感染防御相聯(lián)系，這方面的工作也成為眼下的重點之一。比如有實驗揭示活性氧與天然免疫Toll受體信號途徑的聯(lián)系。我們實驗室曾發(fā)現(xiàn)在泌尿道上皮細胞清除胞內細菌可能有活性氧中的參與。為了深入了解NOX家族與粘膜上皮防御屏障的關系，本文研究建立了NOX1基因熒光素酶報告基因，旨在深入探討NOX1基因表達調控機制，以及該基因與炎癥和免疫反應的關系。通過雙熒光報告系統(tǒng)的檢測，我們觀察到炎癥細胞因子(TNF?α，IFN?γ)刺激可以使實驗組熒光素酶報告基因活性明顯高于對照組，觀察細胞因子作用后不同時間報告基因表達水平，以刺激12小時達到頂峰，然后逐漸下降。本實驗通過報告基因檢測方式，顯示 NOX1基因參與細胞炎癥反應過程，提示有必要進一步研究該基因在免疫防御中的意義。
而NOX1基因表達調控區(qū)段中，細胞因子作用的主要位點，也成為今后研究的重要內容。通過計算機程序(gene?regulation.com)分析，顯示本實驗克隆的NOX1基因上游區(qū)段包含有NF?κB結合位點。NF?κB 轉錄因子家族，在細胞分化、細胞粘附、細胞凋亡、炎癥反應以及天然免疫等過程中發(fā)揮著重要作用[ 6-8] 。細胞因子(特別是TNF?α)刺激NOX1基因表達，NF?κB結合位點是否于此相關，值得進一步的實驗確定。
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